与RNA和蛋白质一样，DNA具备酶的活性，尽管这一特性目前只在体外得到确认。在DNA的众多酶活特性中，可水解切割DNA的DNA（DNA水解自切酶）因其具备作为新型基因编辑工具的潜能受到更多关注。现有的DNA水解自切酶都是从人工合成的包含随机序列（N）的单链（ss）DNA文库中筛选得到的；大约十年前，耶鲁大学的Breaker团队建立了一套强大的体外筛选策略，借助环化酶CircLigase催化线性DNA成环，从环形ssDNA文库中分离出可在DNA骨架任意位点发生水解自切割的DNA序列（图1）。基于此策略，已发现两类（I＆II）高活性的特异感应Zn离子的DNA水解自切酶，其中I类酶在多项生物技术的开发中得到了广泛应用。

图1. 体外筛选可水解切割DNA的DNA

 2021年5月31日，我院顾宏周团队在Nucleic Acids Research期刊上发表题为“New DNA-hydrolyzing DNAs isolated from an ssDNA library carrying a terminal hybridization stem”的工作，通过在ssDNA文库的末端简单地引入互补配对杂交序列，不仅提升了环形ssDNA文库的制备产率（从32%到78%），而且从结构上赋予了文库更多的功能潜力。在双重利好的促进下，两类（III&IV）新型DNA水解自切酶序列被体外筛选所揭示。

 环形ssDNA制备产率的提升可为文库中的初始序列多样性提供更好的保障，而末端杂交序列的存在减轻了筛选中DNA二级结构进化的压力，这一点反映在III类DNA水解自切酶直接雇佣了末端杂交序列作为其催化中心的关键支撑元素（图2左）。

图2. 筛选出的Zn2+依赖型III类DNA水解自切酶在文库母体序列中的定位和二级结构（左）以及水解切割位点的确认（右）

 研究者发现III和IV类DNA水解自切酶均特异感应锌离子，各自在特定位点水解切割DNA（图2右）；两类酶在中性pH条件下催化DNA水解切割的半衰期约为15分钟。通过试管内退化再进化的筛选方式，研究者进一步勾勒出这两类酶的最小二级结构，并确认它们的催化核心均包含约20个高度保守的核苷酸（图3）。

图3. Zn2+依赖型III类和IV类DNA水解自切酶的二级结构及保守序列  

 有意思的是，在由两条序列链配对形成的双分子构建体中，III类酶的保守序列全部集中在被切割的那条DNA链上（图3左）。基于这一特点，研究者展示了可根据任意目标DNA序列（E1&E2），设计相应的III类DNA探针(S1&S2)，经配对后形成III类DNA酶的二级结构，从而触发DNA探针序列的自水解切割，实现对任意DNA目标序列的特异感应和检测（图4）。   

图4.设计Zn-III用于潜在的DNA序列检测

 总之，该工作进一步优化了DNA水解自切酶的体外进化策略，为筛选依托一系列辅因子的DNA水解自切酶奠定了基础；该工作同时揭示了两类新的锌离子依赖型的DNA水解自切酶，并展示了DNA水解自切酶在生物传感检测中的应用潜力。

 据悉，复旦大学生物医学研究院顾宏周研究员为本文的通讯作者，复旦大学生物医学研究院2019级直博生张灿钰为本文的第一作者，复旦大学生物医学研究院何云刚青年研究员为本文提供了数据分析的支持。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkab439