N-糖基化是蛋白质最普遍、复杂及重要的一种翻译后修饰之，位点特异的完整糖肽分析不仅能反映出特定糖型变化，并且可以指向特定的肽段及蛋白，近年来日益受到关注。然而，由于糖苷键和肽键碎裂能量不一致，各种质谱碎裂方式都只能获得部分定性信息，如高能碰撞裂解模式(Higher energy dissociation，HCD)下糖链产生糖和b/y型肽段片段，但可能导致在碎裂过程中失去全部或部分糖链修饰，而电子转移高能裂解模式(Electron transfer dissociation，ETD)能够产生c/z型肽段碎片保留完整的糖链片段，但只能提供部分肽段信息且碎裂效率不高。此外，串级质量标签(Tandem mass tag，TMT)是一种对蛋白质进行标记提高其质谱分析通量的方法，但由于糖链在碎裂的过程中优先获得大部分的能量，而导致TMT报告离子的碎裂容易受到抑制，不能提供准确的定量信息。因此，N-糖基化蛋白质组研究的通量和鉴定深度往往无法同时平衡。

针对位点特异性糖肽高通量定性定量分析的挑战，我院陆豪杰团队提出了一种高通量位点特异性糖蛋白组的研究方法(HTiGQs)，近日以High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis 为题在线发表于National Science Review。

陆豪杰团队长期从事蛋白质糖基化的质谱分析方法及应用研究，在本工作中，他们通过引入三级胺化学标签增加糖肽的电荷数，从而解决了糖肽电荷转移碎裂(ETD)的碎裂效率问题；并通过等重同位素定量标签的引入整体增加了糖肽在高能碰撞诱导解离(HCD)中的碎裂效率，实现了完整糖肽高通量、高准确性的定量研究。该方法一次质谱分析可以完成10例样品的同时采集，将传统方法的分析时间缩短了10倍，并且将糖肽的鉴定率提高了3倍。采用该方法研究了中国人群中90例不同阶段肝病患者血清中IgG 的完整N-糖肽，一共鉴定到了313条IgG 完整N-糖肽，是迄今为止IgG完整N-糖肽最大规模的数据集，并且第一次绘制了肝脏疾病中IgG亚型特异和位点特异的糖基化修饰模式。报道了在由HBV感染的肝炎发展到肝硬化再到肝癌过程中IgG -糖基化动态变化，以及发现了具有高诊断能力的糖肽标志物IgG1-H3N5F1和IgG4-H3N4，实现了对肝病患者不同疾病阶段的区分；并在另外45例样本中进行了靶向质谱的验证，为肝病的早期诊断及精准药物治疗提供了重要的研究思路与理论基础。此外，该方法也被用于研究了正常人血清的N-完整糖肽，仅从10 μL血清中检测到了约2000条完整糖肽，系统的表征了血清完整糖肽的高异质性特点，也揭示了血清中完整糖肽的分布规律。

本文第一作者是复旦大学生物医学研究院研究生孙珍钰，本文的通讯作者张莹和陆豪杰两位教授。上海易算生物科技有限公司的沈诚频博士为本文的生信分析提供了帮助。

图1高通量位点特异性糖蛋白组标志物研究新方法

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nsr/nwac059