人体由人体细胞和人体微生物（主要为人体细菌）组成。每个人体内含有～1014个细菌、300-500菌种和数百万个细菌基因，远远超过人体细胞数量（～1013个细胞）、细胞种类（～200种）和基因数量（～2万个）。人体微生物在人体内发挥什么功能，一直是学术界在思考和研究的科学问题。

陈海威博士早前从“反向遗传学”角度来思考人体微生物的功能（从“人体微生物”到“疾病”），结合GPCR在调控宿主生理和病理活动中的重要性,以宿主GPCR的活化为切入点，鉴定出人体肠道细菌可以分泌活性小分子代谢物（如组胺、苯乙胺、苯丙胺酸等），通过激活宿主GPCR（如组胺受体、多巴胺受体、GPR56/GPR97等）来调节其生理和病理活动，相关工作于2019年发表在Cell上。

近几年，随着体外厌氧培养技术和培养基配方的改善，目前通过体外厌氧培养获得的人体肠道细菌菌株接近30000株。但是GPCR领域的PRESTO-Tango技术是低通量功能性筛选平台，仅适合对～100个样品（对314个GPCR）进行“一对一”功能性筛选。因此，如何对数万种人体细菌菌株的培养上清和数十万个人体小分子代谢物（对314个GPCR）进行功能性筛选，已经成为技术瓶颈，阻碍了学术界对人体微生物（代谢物）功能的深入研究。

2023年6月14日，复旦大学生物医学研究院和复旦大学附属儿科医院双聘PI陈海威博士在Cell发表了题为“Highly multiplexed bioactivity screening reveals human and microbiota metabolome-GPCRome interactions”（陈海威博士为第一作者兼共同通讯作者，耶鲁大学医学院Noah Palm为通讯作者），结合条形码技术和下一代基因测序技术，将PRESTO-Tango技术升级为PRESTO-Salsa筛选平台（Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Salsa），在（96孔板）单孔中集成314个GPCR报告细胞系，用于“一对多”功能筛选。

 PRESTO-Salsa的技术原理是将单个GPCR的活性转化为一个独特的mRNA条形码（图一B），因此（96孔板一个孔里面的）314个GPCR可以转化为314个mRNA条形码；基于下一代基因测序对314个mRNA条形码进行定量，即可计算出（一个孔里面）314个GPCR的活性（图一C）。

图一:PRESTO-Salsa筛选平台的模块，技术原理和工作流程。（A）：PRESTO-Salsa需要GPCR质粒，接头蛋白质粒和PRESTO-Salsa报告质粒这三个模块。（B）PRESTO-Salsa的技术原理。在HEK293T细胞内同时表达GPCR质粒，接头蛋白质粒和PRESTO-Salsa报告质粒。在静息状态下，GPCR与下游接头蛋白（β-arrestin2）的相互作用极弱；①当GPCR被内源性配体激活之后，GPCR招募β-arrestin2；②与β-arrestin2融合的蛋白酶TEV对GPCR上的TEV切割位点（TEVcs）进行切割；③释放出来的转录因子tTA入核并结合在PRESTO-Salsa报告质粒内的TRE启动子上；④促进EGFP/条形码 mRNA的转录。因此，一个GPCR的活性，被转化为一个mRNA条形码信号；通过对mRNA条形码进行定量，即可分析该GPCR是否被活化。（C）PRESTO-Salsa筛选平台的工作流程。①对每个孔里面的PRESTO-Salsa报告细胞（稳定表达b-arrestin2/TEV的HEK293T细胞）共同转染一个GPCR质粒和对应的一个PRESTO-Salsa报告质粒，使其转化为一种GPCR报告细胞，314孔可以得到314种GPCR报告细胞；②转染6小时后，将所有314种GPCR报告细胞消化，混合成一个细胞文库后，重新种回到新的96孔板里；③用不同的配体刺激GPCR报告细胞文库；④-⑤从每个孔里面提取mRNA并反转录成cDNA;⑥每个cDNA样品经过两轮PCR（第一轮用于扩增EGFP/条形码；第二轮用于给每个样品带上标签和接头），然后将所有已经带上标签的PCR产物混合成一个PCR扩增子文库；⑦对PCR扩增子文库进行下一代基因测序；⑧对原始测序数据进行分析，通过对每个样品中的314个mRNA条形码进行定量，来计算实验组中的每一个GPCR的激活倍数。

 PRESTO-Salsa技术可对小分子、多肽、蛋白质、细菌培养上清、血清等多种样品进行活性检测；相比之前的PRESTO-Tango技术，PRESTO-Salsa技术具有高通量，低样品量（即“一滴血”[60 ul]的样品量即可完成对314个GPCR的活性筛选）等两大优点。

图二:PRESTO-Salsa和PRESTO-Tango。

基于PRESTO-Salsa筛选平台，陈海威博士对1041个人体小分子代谢物和435株人体细菌培养上清（对314个GPCR）进行了功能性筛选（注：该样品量是目前市面上可公开获得的最大样品数量；PRESTO-Salsa适合对～10000个样品进行功能性筛选），初步绘制了人体/人体细菌代谢物-GPCRome作用图谱，揭示了：

（1）人体小分子代谢物除了主要激活氨类GPCR，也可以激活多肽类GPCR，蛋白类GPCR，黏附类GPCR和孤儿GPCR;

（2）部分小分子药物在GPCR上存在脱靶效应；

（3）人体细菌培养上清倾向于激活宿主肾上腺素能受体、多巴胺受体、甲酰肽受体、组胺受体和琥珀酸受体；

（4）口腔牙龈卟啉单胞菌分泌的牙龈蛋白酶K通过靶向K290来激活宿主孤儿CD97/ADGRE5。

 由于所有的数据已经开源（http://palmlab.shinyapps.io/presto-salsa/），因此该人体/人体细菌代谢物-GPCRome作用图谱，为学术界系统性思考、研究潜在的：人体/人体细菌代谢物的作用靶点及功能；小分子药物副作用的分子机制；孤儿GPCR内源性配体和生物学功能提供了数据参考。由于PRESTO-Salsa筛选平台只需“一滴血”的样品量（60微升）即可完成对314个GPCR的功能筛选，因此该技术适合对多种疾病（如自身免疫性疾病、代谢性疾病、恶性肿瘤等）样品量极少的病理样本（如血清、脑脊液、肿瘤组织匀浆等）进行功能性筛选，系统性寻找与多种疾病相关的活性分子或生物标志物（如小分子代谢物、多肽类荷尔蒙、蛋白类趋化因子、自身抗体等），为多种疾病的分子诊断和病理学机制研究提供技术支撑。

陈海威课题组的兴趣点在于人体生理学（“人体是如何维持正常生理”）和病理学（“疾病是如何发生的”）。目前课题组主要基于下一代基因测序，开发一系列功能性高通量筛选体系，用于人体微生物及其基因的功能研究；人体代谢物的功能研究；人体信号通路调控网络的绘制；孤儿GPCR内源性配体和功能鉴定；现代中药系统化工程等领域。对上述研究感兴趣的朋友欢迎来信交流：chen_haiwei@fudan.edu.cn。

原文链接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00543-3#%20