近年来，基于CRISPR系统开发的碱基编辑器可以实现DNA上的精确碱基转换。其中，胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）能够在靶向位点实现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的碱基转换。由于存在gRNA依赖性脱靶（gRNA-dependent DNA OT mutations）和gRNA非依赖性脱靶（gRNA-independent DNA OT mutations），早期开发的CBE在治疗中可能会存在安全隐患，需要开发更精准的CBE系统用于临床治疗。为了全面消除胞嘧啶碱基编辑器的脱靶突变，上海科技大学陈佳研究组、复旦大学生物医学研究院杨力研究组与合作者构建了一种能够消除gRNA依赖性和gRNA非依赖性全基因组脱靶突变（gRNA-independent genome-wide OT mutations）以及gRNA非依赖性全转录组水平脱靶突变（gRNA-independent transcriptome-wide OT mutations）的高精准变形式碱基编辑器（transformer base editor， tBE），并成功在疾病动物模型中实现了高效和精准的治疗研究（Wang et al. Nat Cell Biol 2021 ）。

2023年10月4日，复旦大学生物医学研究院杨力研究组与上海科技大学陈佳研究组、李剑峰研究组在Nature Protocols杂志发表的题为Design and application of the transformer base editor in mammalian cells and mice的实验指南论文，详细介绍了tBE系统的工作原理、设计方案以及体内编辑等过程。

 该论文首先详细描述了tBE的工作原理（图1），tBE系统由四种蛋白组成，1）来源于SpCas9的单链切刻酶D10A（nSpCas9）；2）烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV protease）N端片段（TEVn）；3）RNA适体结合蛋白（N22p）与TEV蛋白酶的C端片段（TEVc）；4）包含胞苷脱氨酶催化结构域（mA3CDA1）、胞苷脱氨酶抑制结构域（mA3dCDI）、尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂（UGI）和另一种RNA适体结合蛋白（MCP）所组成的效应子融合蛋白（tBE-V5-mA3）（图一a）。此外，tBE系统还包括含有boxB的sgRNA（sgRNA-boxB）和含有MS2的helper sgRNA（hsgRNA-MS2）（图一a）。

图一：tBE的元件（a）以及工作原理（b）

当tBE系统在细胞中表达时，由于mA3dCDI与mA3CDA1之间通过TEV蛋白酶识别位点相融合，胞苷脱氨酶的活性被抑制（图一b）。这能够避免产生gRNA依赖性和gRNA非依赖性的脱靶突变。当nSpCas9-hsgRNA和nSpCas9-sgRNA同时结合到基因组靶向位点时，hsgRNA-MS2会招募效应蛋白tBE-V5-mA3，而sgRNA-boxB会招募N22p-TEVc融合蛋白。与此同时，游离的TEVn和sgRNA-boxB招募的TEVc结合在靶向位点处组成完整的TEV蛋白酶，从而切除与胞苷脱氨酶融合的mA3dCDI。因此，mA3CDA1的胞苷脱氨酶活性在靶向位点处被激活，产生有效的碱基编辑（图一b）。由于在 tBE 系统中使用的是TEV蛋白酶的分裂版本，导致 mA3dCDI 切除和胞苷脱氨酶活化的三分子反应只发生在靶向位点处（图 一b）。在任何 脱靶 位点（gRNA依赖或gRNA非依赖性），TEVn、TEVc 与 TEV 蛋白酶识别位点互相之间的两分子随机碰撞都不会导致细胞苷脱氨酶的激活（图 一b），从而防止产生脱靶突变。

该论文还介绍了sgRNA-hsgRNA pair的设计方案，在利用tBE对目标靶点进行编辑时，sgRNA-hsgRNA pair的位置选择十分关键。在常用细胞系中筛选出目标靶点的最佳sgRNA-hsgRNA pair后，作者对利用双腺相关病毒（Dual-AAV）包装tBE系统并递送至小鼠体内以检测治疗效果的实验方法进行了详述。接下来，该文还全面详细地介绍了如何检测基因编辑过程中的gRNA依赖性脱靶、gRNA非依赖性脱靶、gRNA非依赖性全基因脱靶以及gRNA非依赖性全转录组脱靶，并列举了实验方法和数据分析工具。

综上，tBE通过巧妙的设计，利用变形式组装实现无脱靶效应的高效精准型碱基编辑，为疾病的临床诊疗提供了安全高效的新方法和新工具。

该论文中，上海科技大学陈佳教授、复旦大学生物医学研究院杨力教授和上海科技大学李剑峰教授为共同通讯作者，陈佳课题组博士研究生韩炆艳，杨力研究组博士研究生高宝青，陈佳课题组博士研究生朱俊杰，李剑峰课题组硕士研究生何宗兴为共同第一作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41596-023-00877-w