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ÄKTA pure 25M

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ÄKTA pure 25M操作规程

一、ÄKTA pure 25M工作原理

ÄKTA pure 25M可用于快速纯化从微克到克水平的蛋白、肽和核酸等目标产物,是一台层析系统,可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用、亲和作用、反向层析等。凝胶过滤层析是根据分子大小(分子量差别在一倍以上)进行分离,是一种非吸附方式,只需一种缓冲液。不同分子按照大小顺序洗出,大分子先洗出,小分子后洗出。离子交换层析是根据分子所带电荷进行分离,又分为阴离子交换和阳离子交换。疏水作用是依据分子之间疏水性的差别进行分离。亲和作用是依据生物分子之间特异的相互作用进行分离。实验前根据自己所要分离蛋白的性质确定所需的分离柱及缓冲液。

二、ÄKTA pure 25M的组件

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三、ÄKTA pure 25M分离纯化系统基本操作步骤

1、开机
打开主机和电脑电源,待仪器自检完毕(指示灯完全点亮不闪烁),双击桌面上UNICORN图标,进入操作界面。单击系统控制 (System Control)。进入System Control 窗口,点击Connect to Systems,在弹出的对话框中选中已连接的系统名称,点击OK 确认连接。

2、准备缓冲液和样品
所有的工作溶液在使用前用低频超声脱气10min。样品必须经过0.22µm的滤膜过滤,也可高速离心后取上清备用。

3、清洗管道
先将A1管道放入平衡液或banding buffering中,将B1管道放入高盐溶液中或elution buffering中,在system control窗口点击manual→pump→pump wash,选中A1,B1管道为ON, execute。泵清洗程序会自动运行结束。

4、柱子安装
选择manual→pump→flow rate,输入流速0.5-1ml/ml,insert;选择manual→Alarms→alarm pre column pressure,设置high alarm(输入填料的耐受压力,可在填料说明书中查到),insert,execute。接柱子时,须等进液管中的液体出来,将柱子的一头与进液管通过接头连接,先不要拧的太紧,等液体从柱子的另一头流出,再用接头将其与出液管相连拧紧,再将进液管端拧紧,这样防止柱子中进入气泡,影响分离效果。

5、手动运行
5.1 平衡
柱子平衡好了(观察电导COND,)。此时将紫外调零,选择manual→Alarm&mon→autozero,exectue,就准备上样了。
5.2 用样品环上样,将样品吸进注射器,推掉气泡,从Syr上样口推入(进样量不得低于样品环的体积的2倍),不要取下注射器。选择manual→flowpath→injectionValve→inject,execute。
5.3 洗脱
用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。选择manual→pump→gradient,按照自己的条件选择target%B(例如100%)和length(例如20min),execute。
5.4 收集
5.4.1 固定体积收集:选择manual→Frac,输入每管收集体积,exectue。
5.4.2 峰收集:选择manual→Frac→Peak_FracParametersUV,输入峰收集参数,insert,输入每管最大收集体积,insert,exectue。
6、编程及自动运行
6.1 点击method editor窗口里工具栏的Tools → method → editor快捷图标,打开对话框。
6.2 按照对话框的要求选择条件,编好后按finish出现编程结果,在变量框中可以更改变量。保存点击工具栏里的保存快捷图标,输入文件名,点击ok。
6.3 运行自动程序:在system control窗口点击工具栏中的RUN打开编好的方法,点击next直到start开始运行。
6.4 运行中,按下工具栏上的hold键表示保持目前的运行模块状态不进入到下一个命令中。点击manual→other→next breakpoint表示进入到下一个模块指令。
6.5 运行结束后,结果自动保存。
7、清洗系统及拆柱
将A1和B1入口放入纯水中,启动pump wash功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后再将A1和B1入口放入20%乙醇中,同样操作将乙醇冲满整个管路保存。系统给柱子一个慢流速,设置系统保护压力,然后先拆柱子的下端,拧上堵头,再拆柱子的上端,拧上堵头。
8、关机
从软件控制系统File→Exit UNICORN退出软件。然后关闭AKTA主机电源,关闭电脑电源。

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