蛋白质组学子平台
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Q Exactive糖蛋白测序仪(超高分辨液质)

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仪器特性

用于蛋白质序列的高覆盖鉴定及蛋白质组的iTRAQ或TMT等标记定量。最高分辨率达到140000。

  • HRAM 和全扫描能力可以自始至终捕获所有样品数据,从而实现回顾性数据分析而无需再次扫描样品

  • 分辨率高达 140,000 FWHM,可消除同量异序同分异构化合物的干扰,在分析复杂基质中的样品时,提高结果可靠性

  • 全扫描和全离子碎片(AIF)模式质量准确度均优于1ppm,可以确保可靠的化合物识别

  • 12Hz 的快速扫描和多路扫描技术特别适合 UHPLC应用

  • 快速极性切换可以获得最多信息

  • AIF 和多重解离技术——源内 CID 和 HCD——可以辅助化合物识别

  • 扩展的质量数范围达到 6,000m/z,可以提高对单电荷小分子和生物分子的检测能力

  • 超过四个数量级的扫描动态范围以及飞克级灵敏度,可以在一次扫描中同时检测痕量级和高丰度化合物

更加可靠地应用于药物发现和代谢组学研究

  • 和三重四极杆质谱相当的定量能力不仅可用于定量分析母体化合物和代谢物,而且在识别确定化合物同时提供更高通量

  • 快速 HRAM Orbitrap 技术可以消除干扰,实现高可靠性的代谢物结构识别,并可完成大规模代谢组学和脂类组学样品分析

  • MS 和 MS/MS 模式中均可进行现快速“扫描到扫描”极性切换,可以在单次进样中完成最多的代谢物检测和识别

可获得更多蛋白组学信息

  • 与 CID 相比,HCD 可以产生更多碎片和更高质量的 MS/MS 谱图,提高识别能力

  • 高谱图质量和宽动态范围可以对其他仪器无法发现的蛋白质进行识别和定量分析。

  • 定量/定性分析能力使蛋白质组学发现实验轻松转换为目标蛋白质定量分析。

高度特异性的环境和食品安全分析

  • 由于该质谱仪的特异性超过三重四极杆 Q-TOF 或 Q-Trap 的水平,使其成为定量/定性筛查平台的首选

  • 数据依赖的全扫描 MS/MS 能力及 HRAM 数据确保每次识别都具有最高可靠性

为临床研究和法医毒理学的定量确证提供高度可靠性

  • SRM 和 HRAM 的结合轻松为内源性类固醇、滥用药物和镇痛剂的定量确证分析提供了高度可靠性。

应用过程

Q Exactive是赛默飞世尔科技新推出的新型四极杆和轨道阱杂交高分辨质谱仪,它将高选择性四极杆的离子过滤与Orbitrap高分辨准确质量数(HR/AM)测量技术相结合,使四极杆母离子选择和傅里叶转换高分辨质谱功能有机地结合,在分辨率、扫描速度和灵敏度性能上进一步提升,并提供各种超高分辨扫描功能,适应不同的应用需要。Q Exactive质谱仪能进行高通量的目标物或非目标物筛选,能够实现高可靠性的确证定量分析,并且可以作为蛋白组学研究的一个通用的质谱平台。

液相系统为Waters公司两维纳升级液相系统,该系统为超高压系统,能够耐受10,000psi压力,因此能够使用细内径、小颗粒填料的色谱柱。

系统包括一台辅助上样泵(Auxiliary Solvent Pump),一台二元纳升级梯度液相泵(Binary Solvent Pump),一台自动进样器(Sample Manager),一个纳升级三通(Nano tee),一台纳升级切换阀、柱温箱(Nano_Valve、Column Oven)、溶剂托盘。二元纳升级梯度泵采用反应迅速的流速传感器、优化的管路、先进的算法,使得流速最低为200 nL/min。 25 µm I.D.管内的两条高压液流在三通处汇合。从三通梯度混合点到捕获柱的系统体积<1 µL。

Q Exactive二维线性电场轨道回旋共振杂交四级杆质谱系统,是整合了四级杆质谱仪和电场轨道阱质量分析器的组合式质谱仪系统。前面是四级杆,进行母离子筛选;后面是Orbitrap高分辨质谱,提供精确分子量,二者之间通过一个弯曲的双曲面四极杆称为C-trap相连接,C-trap的作用是离子聚焦和把离子束推入Orbitrap的装置, C-trap后部是高能碰撞碎裂室(HCD),对所选母离子进行碎裂。

离子源处产生的离子通过离子通道导入四级杆中,四级杆对离子进行m/z筛选后进入一个C-形离子阱(C-trap),再经过C-trap进入Orbitrap质量分析器。通过快速增加Orbitrap中心电极的电压可将C-trap来的离子捕获,捕获的离子围绕中心电极做环形运动并沿中心电极轴向振动。Orbitrap的形状如同纺锤体,由纺锤形中心内电极和左右2个外纺锤半电极组成,仪器工作时,在中心电极逐渐加上直流电压,在Orbitrap内产生特殊几何结构的静电场。当离子进入到Orbitrap室内后,受到中心电场的引力,即开始围绕中心电极作圆周轨道运动,同时离子受到垂直方向的离心力和水平方向的推力,而沿中心内电极作水平和垂直方向的震荡。外电极除限制离子的运行轨道范围,同时检测由离子震荡产生的感应电势,其中水平震荡的频率和分子离子的质荷比(m/z)的关系可由数学公式来描述。外电极输出的信号经过微分放大器放大后由快速傅立叶转换变成频谱,频谱再进而转换为质谱,然后在软件内处理。

主要应用领域:蛋白质组学研究

(1)蛋白鉴定、修饰鉴定,即全谱、修饰谱。
对复杂蛋白质体系,例如组织、细胞等蛋白提取物进行酶解,对混合的肽段进行LCMS分析,鉴定蛋白鉴定或对修饰蛋白进行修饰鉴定。
实验样品可以为
①组织、细胞、体液、细胞分泌蛋白等的蛋白粉末、溶液,进行酶解后进行两维或多维LCMS实验(Shotgun),中间处理还可以添加蛋白或肽段的富集步骤等。
②蛋白经过一维等电聚焦、一维SDS-Page凝胶电泳后,进行胶条切割,蛋白胶条进行胶内酶解后提取肽段,进行一维LCMS实验。
③蛋白进行两维凝胶电泳后,选取感兴趣的胶点进行胶内酶解,通过一维LCMS进行蛋白鉴定。

(2)定量蛋白质组学
① iTRAQ、TMT标记定量
(a). 样品前处理:可参考文献的处理方法,如无特殊需要则采用经典的组织器官蛋白提取方法。
(b). 蛋白样品的定量与酶解:以4组样品为例。每组样品重溶,Bradford蛋白定量,按蛋白量等量取样,形成4组蛋白含量相等的样品。使用Itraq试剂盒对蛋白进行沉淀重溶酶解以及标记。标记后4组样品混合成1个样品。参照试剂盒protocol。
(c). 两维HPLC色谱分离:进行离线两维分离,先使用SCX强阳离子交换柱对肽段进行分离,收集15-30份肽段馏分。肽段真空冻干后,使用反相色谱流动相进行重新溶解,再进行纳升级反相色谱进行分离,使用ThermoFisher公司 LTQ Obitrap XL质谱系统进行数据采集。
第二维反相液相色谱,使用90-120分钟进行分离及平衡,同时质谱检测。
(d). Q Exactive质谱检测:ThermoFisher公司Nano离子源,喷雾电压1.9kV;质谱扫描时间90或120min;实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion);扫描范围400-1800m/z;一级扫描(MS)使用Obitrap,分辨率设定为60000;使用HCD碎裂模式进行标记定量实验,二级扫描使用Obitrap,分辨率设为15000;在MS谱图中选取强度最强的5-10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除,不作为母离子)。
(e). 数据分析:使用数据分析软件Proteome Discoverer进行Sequest™或Mascot检索,检索数据库为Uniprot_sprot数据库,或其他数据库。母离子误差设定为10ppm,碎片离子误差设为0.05Da,酶切方式为全酶切。寻找差异蛋白,差异两倍或三倍以上记为显著。
② 非标记定量
(a). 样品前处理:可参考文献的处理方法,如无特殊需要则采用经典的组织器官蛋白提取方法。
(b). 蛋白样品的定量与酶解:以2组细胞蛋白样品为例。蛋白重溶,Bradford蛋白定量,按蛋白量等量取样,形成蛋白含量相等的2个样品。使用溶液酶解方法进行酶解,最终获得肽段干粉(进行还原烷基化酶解,提高蛋白覆盖率)之后进行2DLC实验。定量和酶解的方法与步骤,参照权威文献protocol。
(c). 两维HPLC色谱分离:肽段真空冻干后,使用反相色谱流动相进行重新溶解,进行在线两维分离,第一维采用强阳离子交换,可根据样品复杂程度设置6-12个梯度,第二维为反相液相色谱,使用60-90分钟进行分离及平衡,同时质谱检测。每个样品可进行三次或多次重复。
(d). Q Exactive质谱检测:ThermoFisher公司离子源,喷雾电压1.9kV;质谱扫描时间90或120min;实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion);扫描范围400-1800m/z;一级扫描(MS)使用Obitrap,分辨率设定为60000;使用HCD碎裂模式进行MS/MS,二级扫描使用Obitrap,分辨率设为15000;在MS谱图中选取强度最强的5-10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除,不作为母离子)。
(e). 数据分析:使用数据分析软件Protein Discoverer 进行Sequest™或Mascot检索,检索数据库为Uniprot_sprot数据库,或其它数据库。母离子误差设定为10ppm,碎片离子误差设为0.05Da,酶切方式为全酶切。检索结果使用Maxquant软件进行检索、卡值过滤,蛋白鉴定及强度结果使用iBAQ算法进行相对定量分析。寻找差异蛋白,差异两倍或三倍以上记为显著。

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