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Biacore X100生物大分子相互作用分析仪

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Biacore X100操作指南

一、仪器原理

表面等离子共振(SPR)是一种物理现象。当入射光以临界角入射到两种不同透明介质(玻璃与溶液)的界面时将产生全反射,且反射光强度在各个角度上都应相同,但若在介质表面镀上一层金属薄膜后,由于入射光可引起金属中自由电子的共振,从而导致反射光在一定角度内大大减弱,其中使反射光完全消失的角度称作共振角。共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变,折射率的变化与结合在金属表面的生物大分子质量成正比。

二、BIAcore X100 系统组件简介

各部分功能:
芯片室:放置芯片
样品盘:放置样品
废液瓶:储存废液
缓冲液瓶:储存缓冲液
进样泵:泵样品,提供流速

三、仪器常规操作(Basic instrument operation)

1 开机
1.1 从关机状态开机
(1)启动电脑和打印机,打开Biacore X100主机电源(右后侧下方),待主机面版上TEMP指示灯停止闪烁,即表示温度已稳定;
(2)启动 Biacore X100 Control Software,登入;
(3)待软件和主机建立连接,约30秒;
(4)确认左侧缓冲液瓶已装入新鲜缓冲液且两根缓冲液管均插入瓶中;
(5)确认右侧废液管已插入废液瓶中;
1.2 从待机状态开机
(1)确认左侧缓冲液瓶已装入新鲜缓冲液且两根缓冲液管均插入瓶中;
(2)确认右侧废液管已插入废液瓶中;启动控制软件并登入;
*关于缓冲液:
(1)请使用新鲜配置的缓冲液,200μl缓冲液约可使用24小时;
(2)缓冲液必须用0.22μm进行过滤,去除杂质;
(3)缓冲液或去离子水必须经过脱气处理(装有X100 Plus Package用户无需脱气);
(4)在Standby状态调换缓冲溶液时,先在Tools中选择Stop Standby,换上缓冲液后,选择Prime即可。

2 芯片的放置

(1)打开芯片室的门;
(2)点击Undock Chip按钮,弹出对话框;
(3)拉开芯片槽导轨,图A;
(4)取出旧芯片,图B;
(5)把新芯片按箭头朝内方向插入,放平,图C;
(6)推入芯片槽导轨,图D;
(7)关上芯片室的门;
(8)点击谈话框内的Dock Chip按钮。
(9)确认缓冲液瓶中有足够的溶液;
(10)点击Tools—〉Prime,用缓冲液润洗整个管道系统。

3 调节温度
装备Plus Package的用户可在Tools—〉Set Temperature选择所需的实验温度(4-40℃)。待温度指示灯Temp停止闪烁后表明系统已达到设置温度。

4 样品的放取
(1)点击Load Samples 图标;
(2)待Rack Locked指示灯熄灭后,将样品盘轻轻提起取出;
(3)将样品放入正确的位置:1-15号可放置1.5ml标准EP管(必须剪去盖子,为防止溶液挥发,最好加上Biacore专配的橡皮塞)。H2O处放置专配的4ml塑料管,每次实验前加入去离子水(切勿加盖),用于清洗进样针。
(4)放回样品盘,点击OK。

四、Biacore X100 实验操作模式
Biacore X100实验设置和控制全部通过Control Software实现。实验可通过两种模式进行:向导模式和手动模式。
向导模式又分为两种:Workflow模式和Template模式。Workflow模式是将一个完整实验的所有步骤都通过一个流程图贯穿起来,结构十分清晰,适合初学者使用。Templatem模式是将每一个实验步骤分开设置,便于操作,适合有经验的使用者。

1 WorkFlow向导模式
1.1 建立Workflow
(1)根据实验目的,选择正确的流程。如果要测定生物分子间的亲和力和动力学,选择“Kinetics/Affinity...”;如果测定两者间有无结合作用,点击“Binding analysis”图标。以下只以亲和力/动力学流程为例说明。
(2)点击模式按键后,弹出对话框
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根据提示,输入正确的配体(Ligand)名称,种类等信息。
(3)软件根据输入的信息,会推荐适合的芯片和偶联方式。请根据实际情况选择(例如:直接偶联或捕获方式偶联)。选择后下方和右侧会出现示意图和流程图。
(4)点击Continue键,保存。
此时,完整的实验流程图出现。图中黄色对话框是必要的实验步骤,浅蓝色对话框内的是可选择的实验步骤。主流程分为两大部分:Sensor Surface Prepairation(芯片表面准备)和Assay(实验)。
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1.2 芯片表面准备
该步骤主要是将配体偶联到芯片表面。如果是首次偶联一个新样品,需要找到合适的偶联pH条件。
1.2.1 Find Immobilization pH
如果样品等电点(PI)未知,推荐顺序使用pH 5.5、5.0、4.5、4.0的醋酸钠溶液进行测试,样品浓度可选择10-50μg/ml,但四个样品浓度需保持一致。进样时间180秒,用50mM NaOH作为清洗溶液。最后可根据结果,选择合适的pH浓度作为偶联条件。
1.2.2 Immobilization
该步骤将配体偶联到芯片上。点击“Immobilize Run”,弹出对话框
7.jpg(1)选择芯片种类(flowwork模式下不可用)。
(2)选择通道(flowwork模式下不可用),通常将Flow Cell 1作为参照通道,Flow cell 2作为样品通道。
(3)选择偶联方法,通常为氨基偶联 Amine。
(4)选择偶联方式:
Aim for immobilized level:以偶联量为目标,输入配体名称,偶联水平(很重要,根据公式计算),洗脱液50 mM NaOH。
Specify contact time: 以固定的接触时间为偶联标准。
(5)点击next,选load sample,取出样品盘
(6)按照表格中的示意图,一一对应放入所需试剂。加入试剂的量不得少于软件要求的用量。试管要去除盖子,样品加入试管后离心一下,除气泡。
(7)将样品盘放回托架,点击next;检查缓冲液等,保存方法和结果文件;点击Run,开始正式偶联。
(8)偶联完成后会显示最终偶联水平。

1.3 实验
1.3.1 Find Sample Conditions

该步骤为可选步骤,可帮助用户了解:

(1)配体是否有活性;(2)确定适合的浓度和接触时间;(3)确定是否需要再生;(4)观察是否有非特异性结合现象存在。
1.3.2 Find Regeneration Conditions
该步骤为可选步骤,可帮助用户选择合适的再生条件。
1.3.3 Run Kinetics/Affinity Assay
点击“Run Kinetics/Affinity Assay”,设定测定亲和力的实验参数。
(1)选择Flow Call和芯片种类(Work Flow模式下不可选)。
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根据实验要求,选择实验的流程和再生的次数。点击Next。
(2)建议勾取prime before run,用缓冲液冲洗管道。
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Startup的sulution 可用缓冲液,次数建议为3-5次,点击Next。
(3)输入进样的参数:
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进样时间(contact time)推荐在180秒,解离时间长短需视样品而定,对未知样品可用600秒尝试。填写再生试剂名称,进样时间通常在30-60秒间。如果再生试剂为SDS,之后需要稳定30-60秒时间。点击Next。
(4) 填写样品名称,分子量,浓度。注意,必须要有一个零浓度和一个重复浓度的样品。点击next。
(5) 按照要求放置样品,检查缓冲液,保存文件,点击Run开始实验。
(6) 实验结束后,结果文件会自动在Evaluation软件中被打开。

五、系统定期维护(System Maintenance)
1 每日或每次实验结束:
任务:清空废液。将芯片取出,用保鲜膜包好置于密闭的塑料袋中,放入4度冰箱冷藏。将缓冲液换成去离子水,确认系统处于Standby状态。请每隔3-4日置换一次去离子水,避免生长细菌。如果超过4天无人值守换水,请关机。
2 每周:
任务:清洁流路系统。使用Tools—〉More Tools—〉Desorb;放入维护芯片(Maintenance Chip);根据程序指令完成清洗工作。
所需试剂:BIAdesorb Solution 1&2;Maintenance Chip;去离子水。
3 每月
任务:清洁流路系统,除菌。使用Tools—〉More Tools—〉Desorb and Sanitize;放入维护芯片(Maintenance Chip);根据程序指令完成清洁工作。
所需试剂:BIAdesorb Solution 1&2;BIAdisinfectant solution;Maintenance Chip;去离子水。
4 系统检测
任务:定期检测系统状态。使用Tools—〉More Tools—〉System Check and Pump Calibration。放入新的CM5芯片,根据程序指令完成检测工作。
所需试剂:BIAtest Solution,新CM5芯片,HBS-EP buffer。
5 关机
任务:关机系统。
(1) 准备一瓶去离子水和一瓶70%乙醇;
(2) 退出芯片;
(3) 选择Tools—〉Shutdown,根据程序要求完成指令;
(4) 程序将冲洗流路并排空IFC内的液体,约十分钟。当系统要求打开管道夹时,请打开前部下方面板,翻起管道夹,如图;
(5) 关闭控制软件,清空玻瓶。
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