基因组与表观基因组学子平台
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PyroMarker Q96焦磷酸测序步骤及概要

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概要

本仪器主要用于检测突变、SNP或者DNA甲基化,可以精确定量,是目前检测DNA甲基化的金标准。

案例



检测DNA甲基化结果图




检测突变结果图


一、样品制作流程

1、亚硫酸氢盐转化:
不同试剂盒步骤不同,只需按照试剂盒操作即可,本实验室用ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit(货号,D5006)。

2、引物设计:
由于重亚硫酸盐处理导致基因组复杂度降低,所以比常规的PCR扩增更难,因此建议用巢式PCR扩增。
(1)确定待测目的序列,同时得到上下游大约300bp的DNA序列;
(2)将序列中的CG用YG替换,并高亮显示;
(3)将剩余C替换为T。(注:步骤1~3模拟重亚硫酸盐处理,Y代表C或T)
(4)确定测序引物:测序引物为待测目的片段的上游碱基,长度25bp左右。
(5)测序引物上游确定两段25~30bp左右的碱基作为外围F1和內围F2引物,目的片段下游确定两段25~30bp左右的碱基作为外围R1和內围R2引物,內围R2引物合成时需要加5’Biotin修饰。
(6)举例如下:红色序列为待测目的序列



测序流程示意图


(7)注:引物设计的几点注意事项
采用巢式PCR;引物长度:25-30bp,适当增减碱基使退火温度合适;避免Poly(T),避免太多YG位点(一般<3个),防止非特异性扩增;PCR产物长度<400bp;测序引物靠近待测序列;如检测多个基因,可以选择合成一条通用Biotin引物,省钱省力。
(8)如果同时检测多个基因,可以设计一条通用的Biotin引物,这样会节省合成Biotin修饰引物的费用,具体原理见示意图:



3、PCR扩增,采用巢式PCR扩增
(1)第一轮PCR扩增,条件如下:



(2)第二轮PCR扩增,条件如下:



(3)琼脂糖凝胶电泳确定条带特异。

二、仪器操作流程

1、在PCR板中,准备微珠预混液配制(每管)
(1)Beads:3μl,Binding Buffer,40μl,模版:20μl,dd Water:补足80μl。
(2)22℃震荡20min(如果准备工作没做好,可延长震荡时间)

2、焦磷酸测序样品准备
(1)清洗探头2-3次,最后一次将探头竖直举起,抽出残余水分,将70%乙醇、变性液、洗液倒入相应的位置
(2)加入碱基和酶、底物,将相应试剂放入仪器



(3)在酶标版中,准备预混液(每管):Anealling Buffer:38.4μl,primer(10umol):1.6μl
(4)探头吸附微珠预混液:探头放置70%乙醇,看到液体从管中出来,探头竖直举起;探头放置变性液,看到液体从管中出来,探头竖直举起;探头放置洗液,看到液体从管中出来,探头竖直举起直至水抽干;将探头对准酶标版,关闭真空,停留3s后,探头置入酶标版,轻轻晃动探头;将酶标版80℃2min,室温放置10min,直至手感不热,放入仪器;
(5)打开CpG software,设置软件,开始,结果举例如下,每个值表示相应位点甲基化值




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