基因组与表观基因组学子平台
首页 > 技术平台 > 基因组与表观基因组学子平台

HiSeq2500测序仪使用流程

预约方法:电话预约

一、测序原理

二代测序(Next generation sequencing, NGS)这一概念是基于1977年Sanger发明的末端终止测序法(一代测序)而言的新一代测序方法,其核心技术是边合成边测序(Sequencing by Synthesis,SBS),即通过使用不同颜色荧光标记的dNTP,当DNA聚合酶与待测的单链DNA文库合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。

二代测序仪已成为基因组(各个物种的全基因组、外显子组)测序、表达谱和转录组(全转录组、数字化基因表达谱、小RNA)测序、表观遗传基因组(ChIP-seq、甲基化、组蛋白修饰、转录因子结合位点)测序等科学研究的首选仪器。

二、HiSeq2500仪器参数

HiSeq2500测序仪有两种测序模式,快速运行模式和高产量模式。



快速运行模式可在1天内得到一个人的全基因组的数据量,并支持双端250 bp的读长。更长的读长实现了更深度的覆盖,改善了de novo应用的组装,并可协助开展长序列的应用。数据质量Q30>90%。

高产量模式在10天左右可以产生600Gb的原始数据,数据质量Q30>80%。升级后的HiSeq SBS Kits v4在每次运行产生40亿个簇,在6天内生成高达1 Tb的数据。

三、测序流程

二代测序的主要流程分为以下几个步骤:测序样品准备(文库制备);将构建好的文库接种到测序芯片(flowcell)上进行文库的簇生成(Cluster on cBot);接种好文库的芯片送到测序仪上进行测序;测序所得数据进行生物信息学分析。



测序流程示意图


1、文库制备
根据不同研究方向的需求,文库构建的方法也千差万别,目前市面上有很多成熟的文库构建试剂,可以根据实际需求适合自己研究需要的试剂盒。下图是基因组DNA建库的一般流程。
注意事项:
(1)二代测序仅测定DNA的碱基信息,即只测定G、T、C、A四种碱基,不能识别U。如果要进行RNA测序,则在文库构建时需要将RNA逆转录成DNA,然后方可进行建库。
(2)根据实验需要,可以同时测定多个文库样本,因此需要给多个文库连接上不同序列的接头(adaptor),以便在测序之后,根据接头序列的不同,将混合文库数据进行拆分。



2、Cluster簇生成
构建好的文库,在cBot簇生成仪上,将文库接种到测序芯片内。文库在接种到芯片上之前,首先要用减将将双链的DNA文库解链成单链,然后才可进行后续步骤。HiSeq2500测序仪对文库的起始浓度和片段长度有要求,一般文库的起始浓度要大于1ng/ul,片段长度在300~500bp为宜。
二代测序分为快速模式和高通量测序模式,两种模式对待测文库的起始浓度的要求也不相同,可参考测序说明书,并根据实际需要进行适当调整。同样的,不同的测序模式,在cBot上也对应有不同的簇生成模式,在选取参数的时候要与所用测序试剂盒的型号相一致。
下图为测序芯片和cBot簇生成仪。测序芯片有两种规格,图示的是高通量模式芯片,一张芯片上有8条通道(lane),而快速模式芯片则只有两条通道。



3、测序
从cBot仪上取下已经接种好文库的测序芯片,放置在测序仪上,根据测序软件的操作界面提示,进行参数设置,即可进行测序。



4、数据分析
测序获得的原始文件(raw data)是fastq文件。根据测序接头的不同,首先将文库拆分,然后根据不同的样本模式(选择不同的分析软件,对数据进行生物信息学分析。例如组蛋白修饰ChIP-seq测序和转录组mRNA测序,分析方法就各不相同。本流程仅介绍实验部分,数据分析暂不赘述。




Top