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复旦大学生物医学研究院顾宏周课题组报道脱氧核酶的活性改进

发表时间:2018-05-25  |  阅读次数:352次  |  字体大小 [ ]

       2018年05月24日,生物医学研究院顾宏周课题组与中山医院李华课题组联合在《ACS Catalysis》上在线发表了题为《 Retraining and Optimizing DNA-hydrolyzing Deoxyribozymes for Robust Single- and Multiple-turnover Activities》的研究论文,揭示了脱氧核酶(deoxyribozymes)的优化策略和在生物工程技术方面的潜在应用价值。

       脱氧核酶是一类特定序列的具有酶活性的单链DNA,可通过“试管内进化”的方法获得。自1994年首次发现以来,已有几十种催化不同反应的脱氧核酶被分离来,包括DNA磷酸化、腺苷化、去糖基化,DNA/RNA连接,RNA切割,以及DNA磷酸二酯键水解等。这类由DNA构成的酶在细胞内天然存在的证据依然在探索中,但将其用于细胞内干预特定的信号通路从而抑制肿瘤的发生和生长已得到了广泛认可和现实应用。

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1. I-R1的突变型分子中突变位点及突变型的反应速率测试

        与蛋白酶相比较,已知的脱氧核酶在单个turnover周期内的反应速率和多个turnover间的转换率都有一定的差距。联合课题组以特异感应锌离子并在特定位点水解切割DNA的I类脱氧核酶为例,对其已知的序列作退化处理构建初始DNA文库,通过体外再次筛选分离得到了脱氧核酶I-R1亚型的三个突变体:I-R1a-c(图1)。与I-R1相比,突变体单个turnover内的反应速率均提高了10倍以上,半衰期缩短到1分钟左右,达到或接近蛋白酶和RNA酶在体外被观察到的反应速率。同时,联合课题组通过简单的热循环操作促进底物和酶之间的结合及分离(图2),将Ι类脱氧核酶的turnover间的转换率提高了约30倍,有效kcat值达到了0.5 min-1,同样接近于蛋白酶的体外活性。该研究为脱氧核酶的系统性优化提供了一种广泛适用的策略,同时也为可水解切割DNA的脱氧核酶作为一种高效的分子生物学工具奠定了基础。

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2. 热循环促进的multiple-turnover反应示意图

       复旦大学顾宏周研究员和李华研究员为论文的共同通讯作者,复旦大学生物医学研究院博士生杜鑫雨和复旦大学附属中山医院博士生仲昕医师为论文的共同第一作者。

论文原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.8b01466 

Xinyu Du,# Xin Zhong,# Wei Li, Hua Li,* Hongzhou Gu.* “Retraining and Optimizing DNA-hydrolyzing Deoxyribozymes for Robust Single- and Multiple-turnover Activities.” ACS Catalysis 2018, DOI: 10.1021/acscatal.8b01466

 




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